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瓊脂糖凝膠電泳遷移速率的影響因素
  • 發(fā)布日期:2021-08-26     信息來源:      瀏覽次數(shù):4739
    • 那么下面上海嘉鵬科技有限公司為大家簡單介紹一下關(guān)于瓊脂糖凝膠電泳注意事項及操作流程:

      1、 DNA的分子大小及構(gòu)型:

      不同構(gòu)型DNA的移動速度次序為:共價閉環(huán)DNAcovalently closed circular,cccDNA>直線DNA>開環(huán)的雙鏈環(huán)狀DNA。線狀雙鏈DNA分子在一定濃度瓊脂糖凝膠中的遷移速率與DNA分子量對數(shù)成反比,分子越大則所受阻力越大,也越難于在凝膠孔隙中蠕行,因而遷移得越慢。當(dāng)瓊脂糖濃度太高時,環(huán)狀DNA(一般為球形)不能進(jìn)入膠中,相對遷移率為0Rm=0),而同等大小的直線雙鏈DNA(剛性棒狀)則可以長軸方向前進(jìn)(Rm>0),由此可見,這三種構(gòu)型的相對遷移率主要取決于凝膠濃度。

       

      2、 瓊脂糖濃度:

      一個給定大小的線狀DNA分子,其遷移速度在不同濃度的瓊脂糖凝膠中各不相同。DNA電泳遷移率的對數(shù)與凝膠濃度成線性關(guān)系。凝膠濃度的選擇取決于DNA分子的大小。分離小于0.5kbDNA段所需膠濃度是 1.2-1.5%,分離大于10kbDNA分子所需膠濃度為0.3-0.7%,DNA段大小間于兩者之間則所需膠濃度為0.8-1.0%。

       

      3、 DNA分子的構(gòu)象 

      當(dāng)DNA分子處于不同構(gòu)象時,它在電場中移動距離不僅和分子量有關(guān),還和它本身構(gòu)象有關(guān)。相同分子量的線狀、開環(huán)和超螺旋DNA在瓊脂糖凝膠中移動速度是不一樣的,超螺旋DNA移動*快,而線狀雙鏈DNA移動*慢。如在電泳鑒定質(zhì)粒純度時發(fā)現(xiàn)凝膠上有數(shù)條DNA帶難以確定是質(zhì)粒DNA不同構(gòu)象引起還是因 為含有其他DNA引起時,可從瓊脂糖凝膠上將DNA帶逐個回收,用同一種限制性內(nèi)切酶分別水解,然后電泳,如在凝膠上出現(xiàn)相同的DNA圖譜,則為同一種 DNA。

       

      4、 電源電壓 

      瓊脂糖凝膠分離大分子DNA實驗條件的研究結(jié)果表明,在低濃度、低電壓下,分離效果較好。在低電壓條件下,線性DNA分子的電泳遷移率與所用的電壓呈正比。但是,在電場強(qiáng)度增加時,不同分子量的DNA段的遷移率將以不同的幅度增長,片段越大,因場強(qiáng)升高引起的遷移率升高幅度也越大,因此電壓增加,瓊脂糖凝膠的有效分離范圍將縮小。要使大于2kbDNA段的分辨率達(dá)到*大電場強(qiáng)度不宜高于5V/cm。

       

      5、 嵌入染料的存在 

      熒光染料溴化乙啶用于檢測瓊脂糖凝膠中的DNA,染料會嵌入到堆積的堿基對之間并拉長線狀和帶缺口的環(huán)狀DNA,使其剛性更強(qiáng),還會使線狀DNA遷移率降低15%。

       

      6、 離子強(qiáng)度影響 

      電泳緩沖液的組成及其離子強(qiáng)度影響DNA的電泳遷移率。在沒有離子存在時(如誤用蒸餾水配制凝膠),電導(dǎo)率*小,幾乎不移動,在高離子強(qiáng)度的緩沖液中(如誤加10×電泳緩沖液),則電導(dǎo)很高并明顯產(chǎn)熱,嚴(yán)重時會引起凝膠熔化或DNA變性。 對于天然的雙鏈DNA,常用的幾種電泳緩沖液有TAE[EDTA (pH8.0)Tris-乙酸],TBE(Tris-硼酸和EDTA),TPE(Tris-磷酸和EDTA),一般配制成濃縮母液,儲于室溫。

       

      以上就是上海嘉鵬科技有限公司為大家整理總結(jié)關(guān)于瓊脂糖凝膠電泳注意事項及操作流程。

       

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