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核酸鑒定方法之濃度
  • 發(fā)布日期:2018-03-06     信息來(lái)源:      瀏覽次數(shù):4175
    • 核酸純化在分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)廣泛應(yīng)用。怎樣獲得高質(zhì)量、高純度的DNA或RNA樣品對(duì)下游實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行至關(guān)重要,因此,對(duì)純化后的核酸進(jìn)行鑒定也是*的步驟。本文簡(jiǎn)單的回顧學(xué)習(xí)一下核酸鑒定的方法。
      核酸鑒定包括:濃度/純度鑒定+完整性鑒定
       
      1.濃度/純度鑒定
       
      (1)紫外分光光度計(jì):
      原理:由于核酸中的堿基都具有共軛雙鍵,所以具有紫外光吸收性質(zhì)。核酸在紫外光譜區(qū)有一條典型的吸收曲線,其吸收高峰在260nm處,吸收低谷在230nm處。蛋白質(zhì)在紫外區(qū)的吸收高峰在280nm處,所以核酸的紫外吸收光譜數(shù)據(jù)是鑒定核酸的重要依據(jù)之一。

      由于核苷酸zui大吸收波長(zhǎng)為260nm,根據(jù)朗伯-比爾定律可計(jì)算出在波長(zhǎng)260nm的紫外線下,1個(gè)OD值的光密度大約相當(dāng)于50µg/ml的雙鏈DNA, 40µg/ml的單鏈RNA。紫外分光光度法只適用于測(cè)定濃度大于0.25µg/ml的核酸溶液。
       
      計(jì)算公式:
      dsDNA(µg/µl)=OD260x50x稀釋倍數(shù)/1000
      RNA(µg/µl)=OD260x40x稀釋倍數(shù)/1000
       
      純凈的DNA OD260/OD280=1.8,制備的樣品DNA比值在1.7-1.9,若洗脫時(shí)不使用洗脫緩沖液而使用去離子水,比值會(huì)偏低,因?yàn)镻H值和離子存在會(huì)影響光的吸收值。

      當(dāng)OD260/OD280< 1.7,表明蛋白質(zhì)含量較高,可用利用酚、異戊醇抽提,再用乙醇沉淀去除。
      當(dāng)OD260/OD280> 2.0,表明RNA含量較高??捎肦NaseA消化后再進(jìn)行純化。
      OD260/OD230的值,一般不小于2.0,若小于2.0,表明有碳水化合物、鹽類(lèi)或有機(jī)試劑污染。
       
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